毕氏酵母流加发酵过程的比生长速率控制

在已建立的毕氏酵母发酵过程结构模型基础上，进行了甲醇流加阶段恒定比生长速率控制研究。实验结果表明，基于模型的甲醇进料策略可以将细胞比生长速率恒定地控制在设定值；在比生长速率均值相等的情况下，恒定比生长速率进料策略较之恒速进料策略蛋白产量更高。     

海藻酸锰固定化细胞的乙醇发酵

以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)为发酵菌株，利用海藻酸锰凝胶代替海藻酸钙，固定化酵母使用寿命明显增加。采用混合糖60g／L(50％葡萄糖、50％木糖)为发酵底物，以250mL三角瓶为反应器，在35℃、150r/min、pH5．0条件下，振荡发酵。结果表明，海藻酸锰树干毕赤固定化增殖酵母细胞能使戊糖和己糖同步发酵，海藻酸锰凝胶耐磷酸盐能力是海藻酸钙凝胶的3倍，海藻酸锰固定化树干毕赤酵母细胞乙醇发酵42d，固定化细胞稳定，总糖利用率为95．8％，乙醇得率为理论得率的92．3％，发酵稳定时间明显长于海藻酸钙固定化酵母细胞乙醇发酵的稳定时间(24d)。     

内皮细胞抑制素在毕节酵母中的表达与活性分析

采用PCR技术从人胎脑cDNA库中扩增了人内皮细胞抑制素基因。经DNA序列分析后将扩增的基因克隆至酵母载体pPICgK，获得的重组质粒pPIC9K-EDN转化毕节酵母GSll5，构建表达内皮细胞抑制素的酵母工程菌P.pastoris GSll5(pPIC9K-EDN)。SDS-PAGE分析结果显示：人内皮细胞抑制素在重组酵母GSll5(pPIC9K-EDN)中获得高效表达。用30L发酵罐构对建的工程菌进行高密度发酵，经甲醇诱导48h，生物量达到250OD，分泌量为150mg/L，发酵液经SP Streamline，SP Sepharose FF阳离子交换柱和SephamseHeparin Hi Trap柱纯化，产物纯度达到98％。纯化产物具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其在医学领域的应用

毕赤酵母表达系统是近几年在外源蛋白表达方面应用比较广泛的一套工具，到目前为止，已用这个系统成功表达了200多种来自病毒、细菌、真菌、动植物和人的蛋白，如人白介素、人血清白蛋白、乙肝表面抗原、水蛭素等。本文就巴斯德酵母细胞的基本特性、宿主菌及其质粒、影响外源蛋白表达的因素和在医学上的应用作一综述。     

人血管内皮抑制素基因在毕赤甲醇酵母中的表达

对发生突变的人血管内皮抑制素基因进行了PCR修正,并将其连接到pAO815载体上,然后克隆进大肠杆菌TOP10F＇中,提取质粒测序,证实序列正确.再用电激法转化毕赤甲醇酵母KM71,利用RDB平板和PCR技术筛选出阳性克隆菌落后,甲醇诱导表达,SDS-PAGE电泳检测显示重组的人血管内皮抑制素蛋自在毕赤甲醇酵母KM71中获得了有效表达.     

红色荧光蛋白在毕赤酵母中的高效表达

报道了红色荧光蛋白(DsRFP)在毕赤酵母中的高水平表达．利用PCR技术从YEpFLAG-1-DsRFP扩增出DsRFP编码序列．克隆到毕赤酵母胞内表达载体pPIC3．5K构建重组表达载体pPIC3．5K-DsRFP．电击转化进毕赤酵母．G418-RDB平板双重筛选后获得重组转化子．经MM／MD平板培养与PCR鉴定．重组子全部为HIS^ -MUT^ 表型．重组菌株诱导表达48h后获得了高效表达．摇瓶中表达水平达到细胞内总蛋白的12％．表达量达到1．8g／L．经硫酸铵分级沉淀，DE-AE-5PW阴离子交换柱层析与S-HyperD阳离子交换柱层析后获得电泳纯蛋白．说明我们建立的毕赤酵母表达应用平台具有高效表达外源蛋白的能力。     

重组毕赤酵母表达reteplase发酵过程中的降解现象

研究了pH和温度对重组毕赤酵母表达retep lase(rPA)发酵过程中的降解现象。在低pH(4.5)诱导条件下,由于蛋白酶活性高,rPA降解严重,表达量几乎为0,提高诱导pH至6.5,蛋白酶活性降低,rPA的表达量最高达到122 m g/L。通过将诱导温度从30°C降低到20°C,rPA的表达量从153.2 m g/L提高到207.9 m g/L。降低温度能减少细胞死亡率,从而减少了发酵液中蛋白酶的释放,降低了蛋白酶的活性,抑制了对目的蛋白rPA的降解。另外,低温使胞内AOX酶活性提高,从而增强了rPA的表达。     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

家蝇防御素defensin cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达

提取家蝇总RNA,RT-PCR扩增编码家蝇防御素defensin的cDNA,克隆并测定了其序列,将该cDNA序列与酵母表达载体pPICZαA重组,构建酵母分泌型表达载体pPICZα-de,电激法转化毕赤酵母(Pichia pasto-ris)受体菌GS115。经表型筛选和PCR鉴定证明目的片段已稳定整合到酵母染色体基因组中。在含不同浓度的Zeoc in平板上筛选到高拷贝整合的转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达,用Tric ine-SDS-PAGE确定了表达产物的正确性,琼脂孔穴平板扩散法、比浊法测定了表达产物的活性,对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus具有一定的杀菌活性。     

人纤溶酶原Kringle 1基因的克隆与表达

从人肝组织中抽提总RNA，通过RT-PCR方法扩增出人纤溶酶原（plasminogen)Kringle 1片段，构建pPIC9K-K1载体，电击转化酵母，成功获得pPIC9K-K1/GS115工程菌，摇瓶发酵初步结果表明，工程菌能稳定表达可溶性的重组K1蛋白，分子量为15kd，发酵液中的蛋白含量为84.17mg/L。